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產(chǎn)品及特點(diǎn)
芹菜花葉病毒(Celery Mosaic Virus，CeMV)屬于馬鈴薯病毒科馬鈴薯Y病毒屬，病毒粒體為線狀，長(zhǎng)度為760～780 nm。芹菜花葉病毒的傳染性和存活率比較高，在自然界中主要通過汁液接觸及蚜蟲傳播，還可從寄主傷口侵入進(jìn)行傳播。不同寄主被侵染后表現(xiàn)出不同的癥狀，苗期受侵染時(shí)，菜心生長(zhǎng)停滯、扭曲、全株矮小甚至枯死，被侵染芹菜產(chǎn)量和品質(zhì)會(huì)受到明顯影響。芹菜花葉病毒會(huì)嚴(yán)重減低芹菜產(chǎn)量，甚至使之喪失商品價(jià)值，因此快速檢測(cè)芹菜花葉病毒具有重要的意義。為此，本公司以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了芹菜花葉病毒的檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
芹菜花葉病毒(Celery Mosaic Virus，CeMV)屬于馬鈴薯病毒科馬鈴薯Y病毒屬，病毒粒體為線狀，長(zhǎng)度為760～780 nm。芹菜花葉病毒的傳染性和存活率比較高，在自然界中主要通過汁液接觸及蚜蟲傳播，還可從寄主傷口侵入進(jìn)行傳播。不同寄主被侵染后表現(xiàn)出不同的癥狀，苗期受侵染時(shí)，菜心生長(zhǎng)停滯、扭曲、全株矮小甚至枯死，被侵染芹菜產(chǎn)量和品質(zhì)會(huì)受到明顯影響。芹菜花葉病毒會(huì)嚴(yán)重減低芹菜產(chǎn)量，甚至使之喪失商品價(jià)值，因此快速檢測(cè)芹菜花葉病毒具有重要的意義。為此，本公司以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了芹菜花葉病毒的檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)芹菜花葉病毒RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法qRT-PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
500μL(本色蓋） |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL(綠色蓋） |
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流腦A,B,Y群探針法qPCR引物-探針混合液 |
150μL(棕色管） |
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流腦A,B,Y群探針法qPCR陽性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL(黃色蓋） |
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使用手冊(cè) |
1份 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165 μL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋PCR陽性對(duì)照以1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要以10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對(duì)照。本陽性對(duì)照由流感A、B和Y群專一性的三種DNA片段組成。
稀釋PCR陽性對(duì)照以1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要以10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對(duì)照。本陽性對(duì)照由流感A、B和Y群專一性的三種DNA片段組成。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號(hào)管中加入5μL 1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照（試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5μL 1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照（上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是樣品制備PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是樣品制備NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL陽性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備PC。另外用水作為樣品制備NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容。
Probe qPCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（用第4號(hào)管中的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為描述操作步驟，
數(shù)據(jù)處理
1. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。一次實(shí)驗(yàn)可以得到三種靶分子的標(biāo)準(zhǔn)曲線，F(xiàn)AM通道得到的數(shù)據(jù)是A群的，HEX通道得到的數(shù)據(jù)是B的，ROX通道得到的數(shù)據(jù)是Y群。
2. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于45。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于40。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于45則為陰性，如果小于或等于40則為陽性。如果在40-45之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果Ct值小于45，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。一次實(shí)驗(yàn)可以得到三種靶分子的Ct，F(xiàn)AM通道得到的數(shù)據(jù)是A群的，HEX通道得到的數(shù)據(jù)是B的，ROX通道得到的數(shù)據(jù)是Y群。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
