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過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物酶活性檢測(cè)試劑盒熒光法
測(cè)定意義
H2O2是生物體內(nèi)最常見(jiàn)的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化產(chǎn)生，由CAT和POD 等催化降解。H2O2不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面，H2O2 可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體；另一方面H2O2也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。
測(cè)定原理
該測(cè)定試劑盒使用 Amplex? Red 試劑（10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪）檢測(cè)過(guò)氧化氫 (H2O2) 或過(guò)氧化物酶活性。Amplex? Red 試劑與辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 配合使用以檢測(cè)從生物樣品（包括細(xì)胞）中釋放或在酶偶聯(lián)反應(yīng)中生成的 H2O2。此外，當(dāng) H2O2過(guò)量時(shí)，Amplex? Red 試劑也可用作過(guò)氧化物酶活性的超靈敏測(cè)定試劑。在存在過(guò)氧化物酶的情況下，Amplex? Red 試劑與 H2O2以 1:1 的化學(xué)計(jì)量比發(fā)生反應(yīng)，生成紅色熒光氧化產(chǎn)物試鹵靈。
需自備的儀器和用品
天平、離心機(jī)、熒光酶標(biāo)儀/酶標(biāo)儀、移液器、渦旋混勻儀、黑色96孔板/酶標(biāo)板、勻漿器。
試劑組成和配制
注意
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試劑名稱 |
規(guī)格 |
數(shù)目 |
貯藏 |
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提取液 |
液體100mL |
x2 |
4℃ |
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試劑一 |
液體200uL |
x1 |
4℃,避光 |
取10μL試劑一和990 μL提取液混勻即為試劑一A |
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試劑二 |
粉劑 |
x1 |
-20℃,避光 |
臨用前加入6mL提取液溶解，分裝凍存，避免反復(fù)凍融。 |
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試劑三 |
粉劑 |
x2 |
-20℃,避光 |
臨用前加入78μL試劑四（預(yù)先恢復(fù)至室溫）溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，不可保存。 |
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試劑四 |
液體 |
x1 |
4℃,避光 |
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注意
正式測(cè)定前務(wù)必取 3 - 5 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。
預(yù)實(shí)驗(yàn)的意義
預(yù)實(shí)驗(yàn)的意義
比色法檢測(cè)試劑盒預(yù)實(shí)驗(yàn)非常重要
1、確定該試劑盒是否適合客戶的樣本檢測(cè)，以免造成試劑盒和樣本的浪費(fèi)（比如低表達(dá)處理的樣本）；
2、熟悉生化試劑盒的操作流程，尤其是初次使用生化試劑盒測(cè)定；
3、確定樣本的處理方法及稀釋倍數(shù)是否合適；
4、了解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象或問(wèn)題，以便于及時(shí)作出調(diào)整；
5、通過(guò)3 - 5組預(yù)實(shí)驗(yàn)，判斷試劑盒對(duì)于樣本的最佳適應(yīng)稀釋濃度范圍，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)樣本稀釋比例。
