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021-54845833/15800441009
測定意義
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要氫受體，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時，形成大量的ROS，同時NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD+降解產(chǎn)物對細胞信號傳導、代謝和基因表達等具有重要的調(diào)控作用。
測定原理
分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD+和NADH，在1-mPMS作用下，WST-8可與NADH 反應，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用WST-8檢測。
需自備的儀器和用品
酶標儀、臺式離心機、移液器、水浴鍋、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
測定步驟
1、酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，蒸餾水調(diào)零。
2、加樣表(在96孔板中按下表依次加樣）：
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試劑名稱（μL） |
測定管 |
空白管 |
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樣本 |
20 |
- |
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蒸餾水 |
- |
20 |
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試劑一 |
160 |
160 |
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試劑二 |
10 |
10 |
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試劑三 |
10 |
10 |
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充分混勻，37℃孵育30min后于450nm處測定吸光值A , 計算△A=A測定管-A空白管。 |
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預實驗的意義
比色法檢測試劑盒預實驗非常重要
1、確定該試劑盒是否適合客戶的樣本檢測，以免造成試劑盒和樣本的浪費（比如低表達處理的樣本）；
2、熟悉生化試劑盒的操作流程，尤其是初次使用生化試劑盒測定；
3、確定樣本的處理方法及稀釋倍數(shù)是否合適；
4、了解實驗過程中可能出現(xiàn)的實驗現(xiàn)象或問題，以便于及時作出調(diào)整；
5、通過3 - 5組預實驗，判斷試劑盒對于樣本的最佳適應稀釋濃度范圍，指導實驗樣本稀釋比例。
注意
正式測定前務必取 3 - 5 個預期差異較大的樣本做預測定。
