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產(chǎn)品及特點
CHO細胞，即中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary），其逆轉錄酶實驗為陽性，具有致瘤的風險。這表明CHO細胞可能攜帶有逆轉錄病毒前病毒，其基因整合入受者基因組可能導致感染；如果存在病毒或傳代細胞基質中的致癌基因，則可能具有引發(fā)腫瘤的潛在風險。因此，中國藥典2020年版三部規(guī)定，以細胞基質生產(chǎn)的生物制劑DNA殘留量不能超過100 pg/劑，以細菌或真菌基質生產(chǎn)的疫苗DNA殘留量不能超過10 ng/劑，同時也規(guī)定，重組乙型肝炎疫苗中CHO細胞殘留DNA不得超過10 pg/劑。由于宿主細胞DNA殘留量的控制是生物制品質量控制中非常重要的環(huán)節(jié)，因此本公司基于熒光定量PCR技術，開發(fā)了專門用于檢測樣品中CHO細胞基因組DNA殘留的本產(chǎn)品，它具有下列特點：
CHO細胞，即中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary），其逆轉錄酶實驗為陽性，具有致瘤的風險。這表明CHO細胞可能攜帶有逆轉錄病毒前病毒，其基因整合入受者基因組可能導致感染；如果存在病毒或傳代細胞基質中的致癌基因，則可能具有引發(fā)腫瘤的潛在風險。因此，中國藥典2020年版三部規(guī)定，以細胞基質生產(chǎn)的生物制劑DNA殘留量不能超過100 pg/劑，以細菌或真菌基質生產(chǎn)的疫苗DNA殘留量不能超過10 ng/劑，同時也規(guī)定，重組乙型肝炎疫苗中CHO細胞殘留DNA不得超過10 pg/劑。由于宿主細胞DNA殘留量的控制是生物制品質量控制中非常重要的環(huán)節(jié)，因此本公司基于熒光定量PCR技術，開發(fā)了專門用于檢測樣品中CHO細胞基因組DNA殘留的本產(chǎn)品，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到 0.01 pg/μL。
3. 特異性高，引物和探針是根據(jù)CHO細胞DNA高度保守區(qū)設計，不會跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應。
4. 既用于定性檢測，又用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
5.本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法熒光定量PCR反應。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×探針法qPCR MasterMix |
625μL |
1.5mL本色管 |
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CHO細胞基因組DNA標準品（1E4 pg/μL） |
250μL |
0.5mL綠色蓋 |
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CHO細胞基因組正向引物干粉 |
50次 |
0.5mL白色蓋 |
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CHO細胞基因組反向引物干粉 |
50次 |
0.5mL藍色蓋 |
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CHO細胞基因組探針干粉 |
50次 |
0.5mL棕色蓋 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物和探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入138 μL的超純水充分混勻后得到的濃度分別為10 μM再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
按自選方法進行核酸純化本試劑盒不相關試劑
按自選方法進行核酸純化本試劑盒不相關試劑
制備標準曲線樣本本試劑盒不相關試劑
1. 標記5個離心管，分別為5、4、3、2、1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭（下同）。
3. 在5號管中加入5 μL 1E4 pg/μL的CHO細胞基因組DNA標準品，
4. 充分震蕩混勻1分鐘，得到1E3 pg /μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E3 pg/μL的CHO細胞基因組DNA標準品(上步稀釋所得)，充分震蕩混勻1分鐘，得到1E2 pg/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 換槍頭，在3號管中加入5 μL 1E2 pg/μL的CHO細胞基因組DNA標準品(上步所得)，充分震蕩混勻1分鐘，得到1E1 pg/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
7. 依次重復上面的操作得到5個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
Probe qPCR反應（25 μL體系，在樣品制備室進行)
8. 配制不含DNA模板的PCR反應混合液。如果有N個待測樣本，做三次重復，做一個無模板陰性對照，做5個梯度的標準曲線樣板，每個PCR反應體系為25 mL，則按下表配制PCR mix：
9. 于96孔反應板每個反應管中分別加上步制備的PCR混合液20 μL，再在陰性對照管中加入水5 μL、在3N個樣本管中加入N個DNA樣本各5 μL（每個三次重復）、在5個標準曲線管中加入5個稀釋度的DNA標準品（來于第二步）各5 μL。在一個管中加水25 μL為背景對照。
10. 反應板覆蓋光學蓋膜后，離心去除氣泡。
11. 將反應板放置在熒光定量PCR儀中運行反應，設定如下參數(shù)。階段1：95℃，10分鐘。階段2：95℃，15秒，60℃ 1分鐘，重復40個循環(huán)。注：PCR反應體系及反應條件可按照具體使用的儀器及試劑進行相應的調整，實驗應在符合檢測要求的潔凈條件下進行，排除核酸和核酸酶的污染。
數(shù)據(jù)處理
1. 取第3到15次循環(huán)的熒光強度均值加10倍標準差，或采用陰性對照熒光值的高點作為熒光閥值。
2. 以至少5個連續(xù)標準品溶液濃度點生成標準曲線，R2值應≥0.98，斜率應在-3.1至-3.8范圍內。
3. 標準品液濃度低點的Ct值，不得高于39。
4. 陰性對照組若有Ct值時，不得低于標準品溶液濃度低點的Ct值:
5. 每組加標樣品的回收率應在50%~150%之間，RSD≤30%。
6. 適當情況下，可剔除第一個或者第六個點，以連續(xù)5個標準品溶液濃度點生成標準曲線，系統(tǒng)適用性仍應滿足以上條件。
7. 以標準品溶液濃度的對數(shù)值對其相應的Ct值作直線回歸，求得直線回歸方程，供試品溶液的Ct值代入直線回歸方程，求出供試品中 DNA殘留量。
自備試劑
熒光PCR專用模板稀釋液
熒光PCR專用模板稀釋液
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
