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猴D型逆轉錄病毒探針法qRT-PCR試劑盒(含內參)
產品及特點
猴D型逆轉錄病毒(Simian Type-D Retrovirus，SRV)是一種單鏈RNA病毒，其基因組長度為8393 nt，屬于逆轉錄病毒科、腫瘤病毒亞科。SRV是猴獲得性免疫缺陷綜合征即猴艾滋病的主要病原體之一，感染的宿主主要是獼猴屬的動物，如恒河猴、食蟹猴和豚尾猴等。SRV在猴群中往往會引起較高的致病率和死亡率，給靈長類動物的健康帶來極大威脅。因此快速靈敏診斷猴D型逆轉錄病毒具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量RT-PCR技術為基礎開發(fā)的專門檢測猴D型逆轉錄病毒的含內參試劑盒，它具有下列特點：
產品及特點
猴D型逆轉錄病毒(Simian Type-D Retrovirus，SRV)是一種單鏈RNA病毒，其基因組長度為8393 nt，屬于逆轉錄病毒科、腫瘤病毒亞科。SRV是猴獲得性免疫缺陷綜合征即猴艾滋病的主要病原體之一，感染的宿主主要是獼猴屬的動物，如恒河猴、食蟹猴和豚尾猴等。SRV在猴群中往往會引起較高的致病率和死亡率，給靈長類動物的健康帶來極大威脅。因此快速靈敏診斷猴D型逆轉錄病毒具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量RT-PCR技術為基礎開發(fā)的專門檢測猴D型逆轉錄病毒的含內參試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/反應。
3. 提供陽性對照，便于制備標準曲線和用作擴增對照，排除假陰性結果。
4. 含識別內源性內參的引物和探針，便于排除RT-PCR假陰性樣本。
5. 特異性高，靶分子的引物和探針是根據猴D型逆轉錄病毒RNA高度保守區(qū)設計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應。
6. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。
7. 本產品足夠50次20μL體系的探針法RT-PCR反應。
8. 本產品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
500μL |
0.5mL藍蓋管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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猴D型逆轉錄病毒RT-PCR引物-探針干粉（含內參引物探針） |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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猴D型逆轉錄病毒RT-PCR陽性對照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入216uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
稀釋標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 在各管中加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液。
3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線陽性樣品。放冰上待用。
樣品RNA的制備
7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是制備PC（樣品制備陽性對照），一個是制備NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂么_認是陽性的樣本作為陽性對照，用確認是陰性的樣本作為陰性對照。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數RNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qRT-PCR反應20μL體系，在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數據處理
1. 陰性陽性判斷：沒有Ct讀數，或Ct大于40判為陰性結果。有Ct讀數，Ct值小于40，熒光信號有對數增長，有典型擴增曲線判為陽性結果。每個樣本需要對FAM通道和Cy5通道的結果分別進行判定，得到兩個結果。
2. 實驗有效性判斷：如果擴增陽性對照或制備陽性對照FAM通道結果為陰性則整個實驗無效，不需要分析數據，需要分析原因，可能是操作、儀器和試劑三方面的原因，重做擴增或制備或跟儀器和試劑廠家聯系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照FAM通道結果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要分析失敗原因，直到污染消除。如果陽性對照和陰性對照正常，則進入下一步分析樣本的有效性。
3. 樣本有效性判斷：如果樣本FAM通道的結果為陽性，則無論內參Cy5通道的結果是陰性還是陽性，樣本的結果均有效。如果樣本結果為陰性，內參通道結果也為陰性，則此樣品的陰性結果無效。此樣品需要重新提取核酸和進行擴增。
4. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，分別以陽性對照FAM通道和內參Cy5通道的Ct值為縱軸，繪制標準曲線，陽性對照FAM通道讀數的標準曲線為斜線，r2必須大于0.95，內參Cy5通道讀數的標準曲線為一條跟X軸平行的橫線。再以待測樣品的Ct值從陽性對照FAM通道讀數的標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
5. 如果用于定性實驗，對待測樣品，如果其FAM通道的Ct沒有讀數、或Ct大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。對任何FAM通道結果為陰性的待測樣本，如果其對應的內參Cy5通道也為陰性，則此樣品的陰性結果無效，此樣品需要重復實驗。
自備試劑
樣品RNA
樣品RNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
