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埃博拉病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
埃博拉病毒(Ebola Virus, EBOV)是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，包含18959個(gè)堿基。埃博拉病毒屬絲狀病毒科，呈長絲狀體，長度為970nm，直徑大約80nm。埃博拉病毒病是由埃博拉病毒引起的一種罕見但嚴(yán)重的人類疾病，可通過野生動(dòng)物（如果蝠、豪豬和非人類靈長目動(dòng)）感染人類，然后通過與感染者的血液、分泌物、器官或其它體液以及被這些液體污染的表面和材料（如被褥、衣服）的直接接觸而在人類群體中傳播。埃博拉病毒病潛伏期一般為5 到12 天，初始表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)/肌肉和腹痛、伴有腹瀉和嘔吐。早期埃博拉病毒容易與其他熱帶病（瘧疾、登革熱）相混淆，至終末出血期才出現(xiàn)具有特征性的內(nèi)臟和皮下出血、嘔血和眼睛充血。如果失血過多，可導(dǎo)致腎功能衰竭、呼吸困難/衰竭、低體溫、休克、彌散性血管內(nèi)出血和死。調(diào)查顯示，埃博拉病毒病平均病死率約為50%，在以往爆發(fā)的疫情中出現(xiàn)的病死率從25%到90%不等。由于埃博拉病毒感染初期癥狀無特異性，因此對埃博拉病毒的快速靈敏診斷具有重要意義。本產(chǎn)品以探針法熒光定量RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測埃博拉病毒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
產(chǎn)品及特點(diǎn)
埃博拉病毒(Ebola Virus, EBOV)是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，包含18959個(gè)堿基。埃博拉病毒屬絲狀病毒科，呈長絲狀體，長度為970nm，直徑大約80nm。埃博拉病毒病是由埃博拉病毒引起的一種罕見但嚴(yán)重的人類疾病，可通過野生動(dòng)物（如果蝠、豪豬和非人類靈長目動(dòng)）感染人類，然后通過與感染者的血液、分泌物、器官或其它體液以及被這些液體污染的表面和材料（如被褥、衣服）的直接接觸而在人類群體中傳播。埃博拉病毒病潛伏期一般為5 到12 天，初始表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)/肌肉和腹痛、伴有腹瀉和嘔吐。早期埃博拉病毒容易與其他熱帶病（瘧疾、登革熱）相混淆，至終末出血期才出現(xiàn)具有特征性的內(nèi)臟和皮下出血、嘔血和眼睛充血。如果失血過多，可導(dǎo)致腎功能衰竭、呼吸困難/衰竭、低體溫、休克、彌散性血管內(nèi)出血和死。調(diào)查顯示，埃博拉病毒病平均病死率約為50%，在以往爆發(fā)的疫情中出現(xiàn)的病死率從25%到90%不等。由于埃博拉病毒感染初期癥狀無特異性，因此對埃博拉病毒的快速靈敏診斷具有重要意義。本產(chǎn)品以探針法熒光定量RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測埃博拉病毒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/μL。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)埃博拉病毒RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法qRT-PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法RT-PCR緩沖液 |
0.5mL |
0.5mL藍(lán)蓋管 |
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探針法RT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR模板專用稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍(lán)蓋 |
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埃博拉病毒qRT-PCR引物-探針干粉 |
1mL |
1.5mL棕色管 |
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埃博拉病毒qRT-PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同。
3. 在6號(hào)管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5μL1×10E5拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
樣品RNA的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是樣品制備PC（樣品制備陽性對照），一個(gè)是樣品制備NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備PC。另外用水作為樣品制備NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。
設(shè)置qRT-PCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對照（用水做模板），5個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對照（用試劑盒提供的陽性對照的10000倍稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴(kuò)增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對照或制備陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無Ct或Ct大于或等于35。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于35，否則實(shí)驗(yàn)無效。如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析待測樣品，如果無Ct或Ct大于或等于35，則為陰性。如果Ct小于35則為陽性。
自備試劑
樣品RNA，超純水
樣品RNA，超純水
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
